實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（qPCR儀） 是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的分子分析儀器，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增過程中的熒光信號變化，實(shí)現(xiàn)對DNA或RNA的高靈敏度定量分析，是生命科學(xué)研究、臨床診斷和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的核心設(shè)備。
根據(jù)熒光標(biāo)記方式不同，主要分為兩類：
熒光染料法：染料與雙鏈DNA結(jié)合后釋放熒光，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單、成本低，但需配合熔解曲線驗(yàn)證產(chǎn)物特異性，避免假陽性。
熒光探針法：探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在Taq酶作用下切割后釋放熒光，特異性高、支持多重檢測，是臨床診斷的主流方案。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備操作要點(diǎn)：
所有試劑、模板全程在冰上操作，避免Taq酶失活；試劑避免反復(fù)凍融，現(xiàn)配現(xiàn)用，優(yōu)先用預(yù)混液配制大體系，大幅減少移液次數(shù)降低隨機(jī)誤差。
耗材優(yōu)先選白色96孔板、高透光學(xué)封板膜和0.2mm薄壁管，白色板比透明板熒光信號增強(qiáng)30-40%，薄壁管熱傳導(dǎo)效率提升25%，適配低豐度靶標(biāo)檢測。
每批實(shí)驗(yàn)必須設(shè)置無模板陰性對照（NTC）和陽性對照，提前驗(yàn)證引物特異性，確保熔解曲線為單峰，無引物二聚體或非特異性擴(kuò)增干擾。
核酸樣本需驗(yàn)證完整性，RNA樣本RIN值≥7.0，用Qubit熒光法定量濃度，去除殘留的肝素、酚類等PCR抑制劑，避免抑制擴(kuò)增效率。
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